Prävention und Bekämpfung von Campylobacter-Infektionen: Ein „One Health“-Ansatz

C. jejuni weist eine herausragende genetische Vielfalt auf, die in erster Linie auf eine häufige natürliche Transformation zurückzuführen ist. In diesem Teilprojekt wurde deshalb der Mechanismus der natürlichen Transformation untersucht. Konkret wurde ein einzelzellbasierter Assay etabliert, in dem die DNA-Aufnahme von Campylobacter im Fluoreszenzmikroskop visualisiert wurde. Unter Verwendung dieses Assays wurden Parameter auf ihre stimulierende bzw. inhibierende Wirkung in der Kompetenzentwicklung, also der Kapazität zur natürlichen Transformation, untersucht. Ein leicht saurer pH-Wert und Sauerstoffstress inhibierten die Kompetenzentwicklung, die vor allem bei motilen und wachsenden C. jejuni stattfand. Weiterhin wurde der DNA-Aufnahmemechanismus durch Herstellung von Mutanten mit Defekten in einzelnen Proteinen näher charakterisiert. Dabei wurde die Funktion von bekannten homologen Proteinen, aber auch ein neues Protein mit Funktion beim Transport der DNA über die äußere Membran identifiziert. Es konnte keine Rolle dieser Gene in der Biofilmbildung nachgewiesen werden, obwohl extrazelluläre DNA als Bindepartner zur Initialisierung von Biofilmen wichtig ist. Der Einfluss von natürlicher Transformation in der Ausprägung von Genvarianten zeigte sich bei C. coli Feldisolaten, die einen erheblichen Sequenzeintrag von C. jejuni aufwiesen. Diese Isolate waren mit der herkömmlichen Routine-PCR nicht mehr als C. coli diagnostizierbar. Auch wurden Auswirkungen auf die Multi-Lokus-Sequenztypisierung entdeckt. Die Daten und ausgewählte Stämme sind für die Validierung des molekularen Anhangs der ISO 10272 eingeflossen und zeigen, dass ein Monitoring von Genomdiversität essentiell für eine kontinuierliche Lebensmittelsicherheit sinnvoll ist. Thermotolerante C. spp. können neben der Adaptation durch genetische Anpassung aber auch lebende und nicht mehr kultivierbare Formen (VBNC) unter Stressbedingungen annehmen. In Kooperation mit der Freien Universität wurde daher das Huhnmo

Um den Prozess von natürlicher Transformation, also die Aufnahme freier externer DNA und die Integration ins Genom besser verstehen zu können und zukünftig gezieltere Reduktionsstrategien vorschlagen zu können, wurde in Förderphase I eine Alternative zum klassischen Transformationsansatz in Campylobacter jejuni etabliert. Der klassische Ansatz beruht auf der Transformation mit DNA, die einen Resistenzmarker enthält. Durch Selektion der transformierten Zellen wird die Transformationsrate bestimmt. Dieser Ansatz ist zeit- und arbeitsaufwendig und durch den Selektionsprozess der Transformanten spielen weitere Faktoren eine Rolle, die das direkte Ergebnis verzerren können. Aus diesen Gründen wurde ein Einzelzell-basierter Assay etabliert, mit dem die DNA-Aufnahme unter Verwendung von Fluoreszenz-markierter DNA mittels Fluoreszenzmikroskop visualisiert werden konnte. Mit diesem Assay konnten stimulierende bzw. inhibierende Effekte von verschiedenen Parametern auf die Kompetenzentwicklung und die DNA-Aufnahme überprüft werden. Dabei zeigte sich, dass die Kompetenzentwicklung, also die Fähigkeit der Aufnahme externer DNA anderer Campylobacter stark pH-abhängig ist. Ein leicht saurer pH-Wert führte zur vollständigen Inhibition von DNA-Aufnahme im Einzelzell-Assay als auch zur drastischen Reduktion der Transformierbarkeit um einen Faktor 105 im Vergleich zu den getesteten optimalen Bedingungen. Diese Ergebnisse ergänzen sich ausgezeichnet mit den Ergebnissen aus IP5, in dem organische Säuren als Reduktionsmittel vorgeschlagen wurden.Um den Prozess der DNA-Aufnahme besser verstehen zu können und zukünftig gezieltere Reduktionsstrategien vorschlagen zu können, wurden Mutanten mit potenziellen Defekten in der natürlichen Transformation hergestellt und mit dem in diesem Projekt etablierten Einzelzell-basierten DNA-Aufnahme Assay auf ihre Kompetenzentwicklung getestet. Dabei wurden Gene mittels Antibiotikainsertionskassetten inaktiviert, die eine mögliche Rolle bei dem direkten Transport des DNA Makromoleküls über beide Membranen des Gram-negativen Bakteriums spielen. Es konnten erfolgreich Mutanten hergestellt werden, die keine Aufnahme von markierter DNA über die Außenmembran in das Periplasma von C. jejuni aufwiesen (pilQ) und daher auch nicht mit einem klassischen Selektionsmarker transformierbar waren. Eine Mutante, die ein inaktiviertes Gen für die strukturelle Einheit des inneren Membrantransporters aufwies (comEC), zeigte wie erwartet keine reduzierte DNA-Aufnahme in das Periplasma, jedoch war der Weitertransport von DNA nicht möglich und daher keine Transformationsaktivität erkennbar. Die Erkenntnisse sind insofern wertvoll, da sie das Verständnis des genetischen Austausches von Campylobacter spp. erhöhen und mögliche Stufen für eine Inhibition der natürlichen Transformation aufzeigen, die in der Zukunft in Kombination mit der Anwendung von Reduktionsstrategien deren Nachhaltigkeit verbessern können. Diese Ergebnisse wurden in der Fachzeitschrift „Biomolecules“ veröffentlicht (Golz et al 2023). In diesem Paper wurde darüber hinaus ein potenzielles Pilusprotein untersucht, welches eine große Rolle in der natürlichen Transformation von C. jejuni spielt. Eine Deletion dieses Gens (cj0683) führte zu einer deutlich verminderten DNA-Aufnahme und Transformationsfähigkeit, die nur leicht oberhalb des Detektionslimits lag. Mittels des etablierten Einzelzellassays, in welchem die DNA-Aufnahme durch Fluoreszenz-markierte DNA visualisiert wird, wurden in der Mutante nur sehr selten DNA-Aufnahme-Ereignisse detektiert. Die Menge der aufgenommenen DNA in diesen seltenen Ereignissen, gemessen anhand der Fluoreszenzintensität der DNA-Foki in den Bakterien, unterschied sich allerdings nicht substantiell vom Wildtyp. Dies deutete darauf hin, dass die DNA-Aufnahmekomplexe zwar selten, dann aber voll funktionsfähig transportierten. Daher könnte es sich bei dem neu-identifizierten und nur in Campylobacter vorkommenden Protein Cj0683 um ein Kompetenzpilusprotein handeln, welches bei der Initialisierung der DNA-Aufnahme beteiligt ist. Das Protein könnte damit ein gutes Target für die Entwicklung von Strategien zur Reduktion des adaptiven Potenzials von Campylobacter darstellen.Bereits in Förderphase I fielen in einem Screening Campylobacter-Isolate auf, bei denen eine routinemäßige Speziesdifferenzierung mittels quantitativer real-time PCR nicht mehr möglich war (Golz et al.kurz füret alii (lat. "und andere"), 2020). Diese Isolate wurden mittels Ganzgenomsequenzierung analysiert. Dabei stellte sich heraus, dass es sich um Campylobacter coli-Stämme handelte, welche erheblichen Sequenzeintrag von C. jejuni erhalten hatte. Bei näherer Analyse fiel auf, dass die Stämme ein gemeinsames Set an Genen, mit C. jejuni Sequenzeintrag teilten. Interessanterweise hatten die Genprodukte eine Funktionalität in der Stressantwort. Darunter waren Funktionen in der oxidativen, osmotischen und generellen Stressantwort, aber auch in Chromosomstabilität und –Reparatur, Membrantransport, Zellwand- und Kapselbiosynthese sowie Chemotaxis. In Förderphase II wurden weitere C.coli/C. jejuni Hybride aus den laufenden Einsendungen identifiziert und mittels Sequenzierung und anschließender K-mer Analyse näher untersucht. Auch in diesen Stämmen wurde das ähnliche Set an Genen mit C. jejuni Sequenzeintrag beobachtet. Die Ergebnisse aus dem Gesamtprojekt lassen die Vermutung zu, dass es sich bei dem C. jejuni Sequenzeintrag um eine Anpassung an harsche Umweltbedingungen handeln könnte. Experimentelle Ansätze zur Darstellung erhöhter Stresstoleranz dieser Stämme gegenüber C. coli oder C. jejuni führten noch zu keinem reproduzierbarem Ergebnis, so dass ein möglicher Fittnessvorteil dieser Hybridstämme weiterhin unklar bleibt. Nichtsdestotrotz zeigt dies, dass natürliche Transformation zu immensem Transfer genetischen Materials zwischen verschiedenen Spezies führen kann. Dies hat Einfluss auf die routinemäßig angewendeten Feintypisierungen und kann zu einer stärkeren Überlebensfähigkeit und damit Persistenz von Campylobacter führen. Aus diesem Grund ist es essentiell sich bei der Suche nach Reduktionsstrategien für Campylobacter auch mit genetischem Austausch zu beschäftigt, damit die Maßnahmen längerfristig greifen. Nur so kann eine stabile und nachhaltige Keimreduktion auf Schlachtkörpern ermöglichet werden.Das NRL für Campylobacter ist Mitglied der CEN/TC463/WG3. Die Thematik der C.coli/C. jejuni Hybridstämme, die zu einer uneindeutigen Speziesdifferenzierung führen kann, wurde bei der Validierung des molekularen Anhangs der ISO 10272-1/2 AMD 2023 berücksichtigt, um auch zukünftig den wandlungsfähigen Keim innerhalb des ÖGDs aber auch in anderen Laboren korrekt nachweisen zu können.Darüber hinaus wurde in Förderphase II ein Tierversuch zur Bestimmung der Infektiosität von Campylobacter im „viable but non culturable“ (VBNC) Status durchgeführt. In diesem Stadium sind Campylobacter zwar lebensfähig und damit potenziell infektiös, lassen sich aber mit den gängigen Methoden nicht mehr anzüchten. Es sind vermutlich Überdauerungsformen für das Überleben ungünstiger Umweltbedingungen. In unseren Experimenten haben wir zwei VBNC Zustände beobachtet. VBNC-1 Formen lassen sich unter Standard ISO 10272-1:2017 Bedingungen nicht anzüchten, weisen aber laut Lebend-qPCR eine völlig intakte Zellhülle auf. Der Beweis für eine Lebensfähigkeit dieser VBNC-1 wurde erbracht, indem die Inkubationsatmosphäre außerhalb der ISO-Norm auf sehr geringe Sauerstoffkonzentrationen mit Zusatz von Wasserstoff eingestellt und die Inkubationszeit um 2 Tage verlängert wurde (Wulsten et al.kurz füret alii (lat. "und andere") 2020). Mit fortschreitender Zeit verändern sich die VBNC-1 in den VBNC-2 Zustand, in dem auch die spezielle Atmosphäre das Wachstum im Labor nicht wiederherstellen kann. Diese VBNC-2 Zellen wurden in der Förderphase II unter kontrollierten Bedingungen hergestellt und anschließend Gruppen von à 10 Hühnern in den Kropf appliziert. Parallel dazu wurden exponentiell wachsende, sich aktiv in vitro teilende C. jejuni im Huhnmodell getestet, um die minimale Infektionsdosis zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigten eine höhere minimale Infekionsdosis von sich exponentiell teilenden Bakterien als derzeit publiziert. Es untermauert die Notwendigkeit von verbesserter, robusterer Diagnostik von C. spp.. Dies könnte z. B. durch die Verwendung der lebend qPCR realisiert werden, die zumindest bei frischen Proben bessere Ergebnisse liefert als der mikrobiologische Goldstandard (Stingl et al.kurz füret alii (lat. "und andere") 2021). Die VBNC-2 Formen konnten in den dargereichten Dosen zu keiner Kolonisierung des Huhns führen. Hier sind weitere Experimente wichtig, die auch die VBNC-1 Formen, die ebenfalls in den Routinelaboren nicht detektiert werden auf Kolonisierungsfähigkeit zu untersuchen. Zudem ist denkbar, dass auch die Darreichungsform und –dauer in zukünftigen Experimenten natürlicher gestaltet werden müsste, z. B. durch Applikation über Tränkwasser, damit das Risiko der Transmission von C. jejuni über VBNC Formen realistisch eingeschätzt werden kann.