Identifizierung neu auftretender Brucella Spezies: neue Bedrohungen für Mensch und Tier

Das IDEMBRU-Projekt konzentriert sich auf neue Brucellose-Bedrohungen. Ziel ist die Entwicklung eines Instrumentariums zum Nachweis und zur Charakterisierung neu auftretender Brucella-Arten und -Reservoire. Diese Bedrohungen umfassen sowohl neu auftretende atypische Brucella-Stämme als auch klassische Arten, die in atypischen Tierwirten (wilde Säugetiere, Amphibien, exotische Haustiere), menschliche Populationen sowie wiederauftauchende klassische pathogene Brucella-Arten, die mit neuen Verzehr- oder Verbringungsmustern (z. B. Rohmilchprodukte oder importierte Produkte tierischen Ursprungs) in Verbindung stehen. Dieses Ziel wird durch einen One Health-Ansatz, sowie durch die Anpassung bestehender -omics Methoden, einschließlich NGS, Proteomik und Metabolomik im Zusammenhang mit neu auftretenden Brucella-Arten erreicht. Dieses Projekt wird keine umfassenden Untersuchungen zu Brucella melitensis und Brucella abortus durchführen, die bereits fester Bestandteil der EU-Sanitärkontroll- und Überwachungspläne sind, es sei denn, es werden eindeutig neue epidemiologische Risiken festgestellt. Die Identifizierung und Quantifizierung neu auftretender Tierreservoire und ihrer Umgebungen wird die Überwachung neuer Brucella-Bedrohungen in den europäischen Ländern verbessern. Bislang wurden neu auftretende Brucellen nicht umfassend in den verschiedenen epidemiologischen Kontexten in Bezug auf die natürliche Landschaft, die Demografie der Viehbestände und die Wildtierpopulationen in Europa untersucht. Epidemiologische Daten, phänotypische und genomische Daten, neue Biomarker und spezifische Merkmale werden integriert, um die neu auftretenden Brucella mit den klassischen Brucella-Arten zu vergleichen, um so die Unterschiede und Besonderheiten dieser neuen Brucella-Spezies zu klären und, was besonders wichtig ist, eine Bewertung des zoonotischen Potenzials und der damit verbundenen Gefahren für die öffentliche Gesundheit zu ermöglichen.

Die am BfRkurz fürBundesinstitut für Risikobewertung erzielten Ergebnisse tragen alle zu Punkt ii) "Charakterisierung der neu auftretenden Brucella-Arten durch Identifizierung der genomischen und phänotypischen Variabilität mittels Hochdurchsatzmethoden" des IDEMBRU-Projekts bei. Die am BfRkurz fürBundesinstitut für Risikobewertung bearbeiteten Aufgaben gliedern sich im Allgemeinen in drei Themenbereiche ein: A. Metabolische Phänotypisierung, B. RNA-Seq als neue Methode zur Identifizierung regulatorischer Prozesse von Brucella spp. und C. MALDI-TOF basierte Brucella-Identifizierung und -Diskriminierung.A. Metabolische Phänotypisierung
Das Brucella BfRkurz fürBundesinstitut für Risikobewertung MICRONAUT™ System ist eine etablierte und gut funktionierende Plattform zur metabolische Phänotypisierung. Dieses Phänotypisierungssystem im 96-Well-Format liefert Informationen über enzymatischen Aktivitäten, z. B. Peptidasen, und die Substratverwertung, z. B. Kohlenhydrate und Aminosäuren, von Brucella spp. und ermöglicht so deren Identifizierung und Unterscheidung anhand von Stoffwechselmerkmalen. Unsere Arbeit mit dem MICRONAUT™-System zeigte deutlich, dass die atypischen Brucella-Arten wie B. microti und B. inopinata, aber auch Brucella-Isolate aus Fröschen und die ehemaligen Ochrobactrum-Arten O. anthropi und O. intermedium im Vergleich zu klassischen Brucella-Arten wie B. suis und B. melitensis deutlich erweiterte und unterscheidbare Stoffwechselaktivitäten aufweisen. Im Gegensatz dazu erschwert die geringere Stoffwechselaktivität der atypischen B. vulpis und der aus Nagetieren isolierten Brucella-Stämme die Unterscheidung zu B. suis und B. melitensis. Leider wurde die Produktion dieses kommerziellen MICRONAUT™-Systems für die Brucella-Phänotypisierung während des ersten Quartals des IDEMBRU-Projekts eingestellt. Daher konzentrierten wir uns auf das BIOLOG™ Phänotyp-Mikroarray-System, um unser Ziel, die metabolischen Eigenschaften atypischer Brucella-Spezies zu charakterisieren, zu erreichen. Mit dem BIOLOG™ Phänotyp-Mikroarrays werden nicht direkt die enzymatischen Aktivitäten der Bakterien und das Wachstum untersucht, sondern es wird die Stoffwechselaktivität bei der Substratverwertung unabhängig vom Wachstum gemessen. Bei den langsam wachsenden Isolaten von B. papionis und B. vulpis beobachteten wir unterschiedliche Muster der Substratverwertung, wobei Substrate in ähnlicher (z. B. Glukose, Succinat, Citrat) oder unähnlicher (z. B. Glutamat) Weise verstoffwechselt oder nicht verstoffwechselt wurden. Die BIOLOG™-Phänotyp-Microarray-Analyse war jedoch für die hochgradig stoffwechselaktive und schnell wachsende B. microti nicht anwendbar, da Negativ- und Positivkontrollen im Versuchsaufbau nicht unterschieden werden konnten. Wir beobachteten unspezifische positive Reaktionen in allen 96 Vertiefungen der Mikrotiterplatte. Das BIOLOG™ System bedarf also einer weiteren Optimierung für die Testung von stoffwechselaktiven Brucella spp. Diese umfassenden Modifikationen innerhalb des kommerziellen Testsystems konnten jedoch während des Förderzeitraums nicht etabliert und umgesetzt werden. Die metabolische Phänotypisierung atypischer Brucella-Spezies ist eine Voraussetzung für eine Teilaufgabe im Rahmen Themenbereiches zur RNA-Sequenzierung (B). Um diese Aufgabe zu erfüllen, ergänzten wir unseren MICRONAUT™- und BIOLOG™-basierten Stoffwechselvergleich zwischen typischen und atypischen Brucella-Spezies durch einen alternativen experimentellen Ansatz. So führten wir Substratnutzungsexperimente in einem definierten Minimalmedium durch, dass mit einer einzigen Kohlenstoff- oder anderen Energiequelle ergänzt wurde. Dieses Minimalmedium war eine Abwandlung des von Plommet veröffentlichten Mediums, das ausschließlich Salze und Vitamine enthielt und das Wachstum der getesteten Brucella-Stämme nicht signifikant förderte [doi: 10.1016/s0934-8840(11)80165-9]. Insgesamt wurden 40 Substraten, darunter Amino- und organische Säuren, ihre jeweiligen Derivate sowie Zucker oder Zuckeralkohole, einzeln auf ihre wachstumsfördernden Eigenschaften mit typischen und atypischen Brucella spp. und früheren Ochrobactrum-Isolaten getestet. Dieser Ansatz unterstreicht die Fähigkeit neuartiger Isolate, auf einzelnen Energiequellen zu wachsen, was sie von den klassischen Brucella spp. mit ihrem typischen anspruchsvollen Wachstumsphänotyp unterscheidet. Die neuartigen atypischen Brucella spp. weisen ein breites Verwertungsspektrum von Kohlenhydraten und organischen Säuren auf, wobei die größte Vielfalt bei der Verwertung von Aminosäuren und deren Derivaten besteht. Auffallend ist, dass kein Stamm der klassischen Brucella-Arten in der Lage war, sich unter diesen eingeschränkten Nährstoffbedingungen mit einem der verwendeten Substrate zu vermehren. Ähnliche Wachstumscharakteristika zeigte B. vulpis, der zu den non-core Brucella spp. gehört. Das aus einem australischen Nager stammendes Isolat Brucella sp. NF2627 zeigte ein stark eingeschränktes Substratnutzungsmuster, konnte aber auf bestimmten Zuckern, Erythrit, Pyruvat, Laktat und den Aminosäuren Prolin und Lysin gut wachsen.

Wie unsere Phänotypisierungen mittels dem Brucella BfRkurz fürBundesinstitut für Risikobewertung MICRONAUT™ System [doi: 10.1186/1471-2180-10-269; doi: 10.1038/srep44420] gezeigt haben, nutzen andere non-core Brucella spp. sowie die ehemaligen O. anthropi und O. intermedium im Gegensatz zu den typischen klassischen Brucella spp. eine breite Palette von Substraten für ihr Wachstum. Unsere Analyse ergab ein sehr variables Substratnutzungsmuster für die getesteten B. microti-Isolate, was eine frühere Studie über die genetische und phänotypische Vielfalt bei B. microti unterstützt [doi: 10.1128/aem.06351-11]. Interessanterweise konnten einige B. microti-Isolate Ectoin katabolisieren und darauf wachsen, was zuvor nur für Brucella-Isolate aus dem Pac-Man-Frosch und dem ehemaligen O. anthropi beschrieben wurde [doi: 10.3389/fcimb.2016.00116].Die untersuchten Brucella-Isolate aus Fröschen vermehrten sich mit einer (im Vergleich zu klassischen Brucella spp.) erweiterten, aber weniger vielfältigen Anzahl von Substraten im Vergleich zu B. microti, die den Wachstumsphänotypen von B. inopinata BO1 und B. inopinata-like BO2 am ähnlichsten sind. Unerwarteterweise waren nicht alle Brucella-Frosch-Isolate in der Lage, Rhamnose zu verstoffwechseln, wie erstmals für das aus einem Pac-Man-Frosch gewonnene Isolat B. sp. B13-0095 beschrieben [doi: 10.3389/fcimb.2016.00116].Die ehemaligen Arten O. anthropi und O. intermedium waren in der Lage, die meisten Substrate zu nutzen und wuchsen auf 35 bzw. 34 der 40 getesteten Substanzen. In unserem Versuchsaufbau wurden mehrere Substrate identifiziert, die eine Unterscheidung zwischen den ehemaligen Ochrobactrum- und den atypischen Brucella spp. ermöglichten, ein Merkmal, das potenziell für die Diagnostik genutzt werden könnte. Nur O. anthropi und O. intermedium, aber keines der getesteten atypischen Brucella-Isolate vermehrte sich mit Zitronensäure, Gluconsäure und Mannitol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle in dem definierten Minimalmedium. Im Gegensatz dazu waren alle getesteten atypischen Brucella-Isolate, nicht aber die ehemaligen Arten O. anthropi und O. intermedium, in der Lage, auf Adipinsäure als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen.
B. RNA-Seq als neue Methode zur Identifizierung regulatorischer Prozesse von Brucella spp.Wir haben mehrere RNA-seq-Kits für verschiedene Brucella-Spezies getestet. Auf der Grundlage unserer Experimente wurde ein geeignetes Protokoll entwickelt. Dieses Protokoll kann für die Brucella-Kultivierung, RNA-Extraktion, Qualitätskontrolle, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung verwendet werden.
Unser Pilotexperiment befasste sich mit Umweltbedingungen, denen neu auftretende Brucella spp. ausgesetzt sein könnten [doi: 10.3389/fmicb.2021.794535]). Über-Nacht-Kulturen von B. vulpis F60 und B. microti CCM4915 wurden verwendet, um Gerhardt's Minimalmedium bei pH 7 und pH 4,5 in dreifacher Ausführung zu beimpfen. Die wachstumsphasenabhängige vergleichende RNA-seq-basierte Transkriptomanalyse wurde an Proben durchgeführt, die eine OD600 >0,5 erreichten. Die Proben wurden gemäß dem entwickelten Protokoll bearbeitet. Für die Bestimmung von Transkripten und die explorative differenzielle Datenanalyse verwendeten wir die Bioinformatik-Tools kallisto bzw. sleuth [doi: 10.1038/nbt.3519; doi: 10.1038/nmeth.4324]. Volcano-Plots für B. vulpis und B. microti wiesen auf eine Regulierung innerhalb der Arten hin, da viele Transkripte als Reaktion auf Säure-Stress in beiden Arten unterschiedlich exprimiert (hoch- oder herunterreguliert) wurden. Darüber hinaus wurde die Komplexität der beiden Spezies-bezogenen Datensätze mit Hilfe einer Hauptkomponentenanalyse (principle component analysis - PCA) reduziert. Die Proben des B. vulpis-Datensatzes zeigten in der PCA eine klare Gruppierung der Triplikate entsprechend der experimentellen Bedingungen (d. h. pH7 vs. pH4,5), wobei die Heterogenität innerhalb der Replikate mit niedrigem pH-Wert etwas größer war als bei neutralem pH-Wert. Die Unterschiede zwischen diesen Clustern sind bei der 1. Hauptkomponente (PC1) größer als bei der 2. Hauptkomponente (PC2). Im Gegensatz dazu war die PCA des B. microti-Datensatzes weniger schlüssig. Hier korrelierten die Replikate mit neutralem pH-Wert miteinander und bildeten eine zusammenhängende Gruppe, während die Replikate mit niedrigem pH-Wert eine große Variation und somit eine schwache Korrelation zwischen den technischen Replikaten aufwiesen. Zwei Proben korrelierten und lagen eng beieinander, während die andere Probe Unterschiede aufwies, die sie auf PC1 und PC2 voneinander trennten. Diese Heterogenität innerhalb der technischen Replikate des niedrigen pH-Werts des B. microti-Datensatzes machte die Unterscheidung der Versuchsbedingungen auf der Grundlage der Gruppierungen weniger eindeutig als beim B. vulpis-Datensatz.

Generell verdeutlichen diese unterschiedlichen Datensätze, dass RNA-seq-Experimente selbst von einem Spezialisten, der diese Experimente zunächst im Labor und anschließend die bioinformatischen Analysen durchführte, nicht einfach umgesetzt werden können. In der Mitte des IDEMBRU-Projekts verließ die zuständige Person unser Labor, was zu einem massiven Verlust von Schlüsselwissen im Bereich RNA-seq und der notwendigen bioinformatischen Analysen führte (brain drain). SOPs und bioinformatische Pipelines konnten vor diesem Wechsel und ohne neue Expertise nicht etabliert werden. Darüber hinaus wirkte sich die SARS-CoV-2-Pandemie negativ auf die Rekrutierung neuer RNA-Spezialisten aus. Schließlich erforderte die metabolische Phänotypisierung enorme Ressourcen, da gut etablierte, kommerziell erhältliche Assays vom Markt genommen wurden.
C. MALDI-TOF basierte Brucella-Identifizierung und -Diskriminierung
Dieses Thema war in hohem Maße von der Zusammenarbeit und dem Austausch von Stämmen zwischen den IDEMRBU-Projektpartnern abhängig, um eine Vielzahl neu auftretender Arten und deren proteomische Fingerabdrücke zu sammeln. Das FLIkurz fürFriedrich-Loeffler-Institut lieferte zehn neue atypische Brucella-Isolate, die sequenziert und mittels MALDI-TOF MS analysiert wurden. Unsere hauseigene MALDI-TOF MS Spektrenbibliothek, die überwiegend aus klassischen Brucella-Isolaten besteht, wurde durch die Integration der verarbeiteten neuen Brucella-Isolate aus dem FLIkurz fürFriedrich-Loeffler-Institut sowie durch alle neuen Brucella-Isolate aus unserer eigenen Stammsammlung erweitert. Um die Unterscheidungsfähigkeit zu erhöhen, haben wir auch die Spektren früherer Ochrobactrum-Arten, nämlich O. intermedium und O. anthropi, integriert. Wir analysierten alle neu integrierten Spektren und identifizierten artspezifische Biomarker-Peaks für die neuen Arten und Isolate durch Vergleich aller Massenspektralmuster. Der zuvor berichtete gattungsspezifische Peak für Brucella wurde in unserem Datensatz bestätigt [doi: 10.1371/journal.pntd.0006874]. Darüber hinaus wurde in dem erweiterten Datensatz ein Biomarker-Peak identifiziert, der in ehemaligen O. anthropi und O. intermedium fehlt, aber in der etablierten Gattung Brucella - einschließlich aller core- und non-core-Brucella spp. - vorhanden ist. Proben, die zur ehemaligen Gattung Ochrobactrum gehörten, wiesen einzigartige Peaks auf, die bei allen core- und non-core-Brucella spp. fehlten. Darüber hinaus wurde die Unterscheidung der beiden Ochrobactrum-Arten innerhalb der erweiterten Brucella-Gattung durch zusätzliche Biomarker-Peaks erreicht. Zusätzlich zu den Biomarkern der ehemaligen Ochrobactrum spp. wurden spezifische Peaks für alle neuen Brucella-Arten identifiziert. Somit sind wir mit unserer Spektrenbibliothek in der Lage, alle derzeit integrierten Brucella-Arten zu identifizieren und zu unterscheiden. Ein Manuskript, dass die Unterscheidung von neuen und atypischen Brucella-Arten anhand von Biomarkersignalen in Massenspektralbibliotheken adressiert, ist derzeit in Arbeit [Kühn et al.kurz füret alii (lat. "und andere"), in Bearbeitung].