Verbesserung der phänotypischen Antibiotikaresistenztestung durch die Entwicklung schneller und sensitiver Screeningverfahren für aufkommende Resistenzen und die Bestimmung fehlender ECOFFs (EJP IMPART)

Antimikrobielle Resistenzen (AMRkurz fürAntimicrobial resistance (Resistenzen gegenüber Wirkstoffen)) stellen eine zunehmende Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar. Im EU Aktionsplan Against the rising threats from AMRkurz fürAntimicrobial resistance (Resistenzen gegenüber Wirkstoffen): Road Map (EU 2015) wird eine verstärkte gemeinsame, grenzübergreifende Forschung zum Thema AMRkurz fürAntimicrobial resistance (Resistenzen gegenüber Wirkstoffen) gefordert, z.B. durch diagnostische Entwicklungen zum Nachweis von Bakterien und Resistenzmarkern sowie der Monitoring-Harmonisierung. IMPART adressiert vier Themen bezüglich der Entwcklung und Harmonisierung phänotypischer Methoden zum Nachweis von AMRkurz fürAntimicrobial resistance (Resistenzen gegenüber Wirkstoffen): Selektive Isolation und Nachweis Colistin-resistenter Enterobacteriaceae (1), sowie Carbapenemase-bildender Enterobacteriaceae (2), Standardisierung der Disk Diiffusion zur Empfindlichkeitsbestimmung von Clostridioides (C.) difficile (3), Bestimmung von ECOFFs für spezifische Erreger/Antibiotika-Kombinationen (4). Das Projekt wird validierte und sensitive Nachweismethoden für Colistin-resistente (mcr-tragende) and Carbapenemase-produzierende Enterobacteriaceae (CPE) in tierischen Blinddarm-Proben und Lebensmitteln bereitstellen. Diese sind entscheidend für eine Überwachung der aktuellen PrävalenzDialog schließenPrävalenzPrävalenzZum Glossareintrag und Ausbreitung von Bakterien, die diese zunehmend verbreiteten Resistenzgene tragen, tierischen Ursprungs sowie des Risikos der Übertragung solcher Resistenzgene über Lebensmittel. Um zudem eine geeignete und kostengünstige Methode zur Antibiotikaresistenzbestimmung des Zoonoseeerregers C. difficile bereitzustellen, wird eine Disk Diffusionsmethode für eine breite Auswahl an Antibiotika optimiert und standardisiert. Die ermittelten Verteilungen der Hemmhofdurchmesser werden zukünftige Arbeiten zur Etablierung von epidemiologischen Grenzwerten (ECOFFs) unterstützen. Desweiteren wird die Bestimmung von ECOFFs für Tierpathogene deutlich die Harmonisierung des Monitorings deren Resistenz verbessern und den Prozess zur Bestimmung von tierspeziesspezifischen klinischen Grenzwerten erleichtern, was letztlich zu einem geringeren Antibiotikaeinsatz im Tier führt.

In WP1 wurden verschiedene Protokolle und Medien für den selektiven Nachweis Colistin-resistenter Enterobacteriaceen verglichen, welche seit der Entdeckung mobiler Resistenzgene (mcr) ein mögliches Problem in der Behandlung schwerer Infektionen in der Humanmedizin darstellt. Ziel war es, eine einheitliche Methode zu validieren. Der innerhalb des Konsortiums durchgeführte Ringversuch zeigte eine 100%ige Spezifität der Molekularbiologie für die Bestätigung von mcr-Genen. Der selektive Nachweis resistenter Bakterien unter Verwendung verschiedener Anreicherungs- und Kultivierungverfahren konnte jedoch nicht ausreichend standardisiert werden. In WP2 wurde untersucht, ob und ggf. wie der Nachweis von Carbapenemase-bildenden E. coli gegenüber den in den Protokollen des EURL vorgegebenen Methoden verbessert werden kann. Die am BfRkurz fürBundesinstitut für Risikobewertung im Rahmen einer Dissertation durchgeführten Untersuchungen diverser Einflussfaktoren konnten zeigen, dass eine möglichst kurze Lagerung und die Wahl des Selektivmediums einen signifikanten Einfluss auf den kulturellen Nachweis der resistenten Bakterien haben. In zwischen den Projektteilnehmern ausgerichteten Ringversuchen wurden verschiedene kommerzielle Medien verglichen und die Ergebnisse publiziert. Im Rahmen der Arbeiten am BfRkurz fürBundesinstitut für Risikobewertung konnte gezeigt werden, dass ein selbstgefertigtes Medium eine signifikant höhere Sensitivität im Nachweis von Bakterien mit nur leicht erhöhter Carbapenemtoleranz hat, als das bestgetestete kommerzielle Medium. In WP3 wurden Empfindlichkeitswerte verschiedener tierpathogener Bakterien gegenüber Antibiotika ermittelt. Die Ergebnisse sind die Grundlage, um im Rahmen der Resistenztestung zukünftig mehr Grenzwerte für die Behandlung bakterieller Infektionen in Nutztieren bereitstellen zu können. Sowohl die untersuchten Bakterienspezies als auch die getesteten Antibiotika wurden nach ihrer Relevanz in der Veterinärmedizin ausgewählt. Die gewonnenen Ergebnisse wurden für die Erweiterung der Datenbanken des European Committe for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) zur Verfügung gestellt und werden dort für die Festlegung Epidemiologischer Cut Off Werte (ECOFF) genutzt. In WP4 wurde mit der Disk Diffusion eine kostengünstige und einfach anzuwendende Alternativmethode zum bisherigen Goldstandard, der Agar Dilution, für die Resistenztestung von Clostridioides (C.) difficile optimiert und validiert. Hierzu wurden verschiedene Nährmedien getestet, vor allem jedoch der Einfluss anaerober Bedingungen in Hinsicht auf eine hohe Reproduzierbarkeit untersucht. Zudem wurden 500 Teststämme aus unserer Stammsammlung sowie Projektpartnern und Dritten gesammelt, charakterisiert und letztlich für die Empfehlung von Grenzwerten zur Resistenztestung gegen acht verschiedene Antibiotika mittels Disk Diffusion genutzt. Mit Hilfe dieser Grenzwerte und einer optimierten Methodenempfehlung, die in einem Ringversuch evaluiert wurde, lässt sich die Empfindlichkeit von C. difficile gegenüber sechs der acht getesteten Antibiotika verlässlich vorhersagen.
Publikationen aus dem Projekt:Perrin-Guyomard, A., Granier, S.A., Slettemeås, J.S., Anjum, M., Randall, L., AbuOun, M., Pauly, N., Irrgang, A., Hammerl, J.A., Kjeldgaard, J.S., Hammerum, A., Franco, A., Skarżyńska, M., Kamińska, E., Wasyl, D., Dierikx, C., Börjesson, S., Geurts, Y., Haenni, M. and Veldman, K. (2022). Multicentre evaluation of a selective isolation protocol for detection of mcr-positive E. coli and Salmonella spp. in food-producing animals and meat. Letters in Applied Microbiology. Early view. DOI: https://doi.org/10.1111/lam.13717Dierikx C., Börjesson S., Perrin-Guyomard A., Haenni M., Norström M., Divon H. H., Ilag H. K., Granier S. A., Hammerum A., Sejer Kjeldgaard J., Pauly N., Randall L., Anjum M. F., Smialowska A., Franco A., Veldman K., Schau Slettemeås J. (2022). A European multicenter evaluation study to investigate the performance on commercially available selective agar plates for the detection of carbapenemase producing Enterobacteriaceae. Journal of Microbiological Methods. 193:106418 DOI: https://doi.org/10.1016/j.mimet.2022.106418.Pauly, N., Hammerl, J. A., Grobbel, M., Käsbohrer, A., Tenhagen, B-A., Malorny, B., Schwarz, S., Meemken, D., Irrgang, A. (2021). Identification of a blaVIM-1-Carrying IncA/C2 Multiresistance Plasmid in an Escherichia coli Isolate Recovered from the German Food Chain. Microorganisms.  9(1), 29. DOI: https://doi.org/10.3390/microorganisms9010029Perrin-Guyomard, A., Granier, S., Haenni, M., Slettemeås, J. S., Ilag, H. K., Anjum, M., Randall, L., AbuOun, M., Pauly, N., Irrgang, A., Hammerl, J. A., Svendsen, C. A., Kjeldgaard, J. S., Hammerum, A., Franco, A., Skarżyńska, M., Kamińska, E., Wasyl, D., Dierikx, C., Börjesson, S., Geurts, Y. & Veldman, K. (2021). Multicentre evaluation of culture based methods to selectively isolate Colistin-resistant Enterobacteriaceae from food producing animals and food products. Poster presentation at OHEJP Annual Scientific Meeting 2021, Copenhagen, Denmark. 9-11  June 2021. DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.7390564Pauly, N., Klaar, Y., Skladnikiewicz-Ziemer, T., Juraschek, K., Grobbel, M., Hammerl, JA., Hemmers, L., Käsbohrer, A., Schwarz, S., Meemken, D., Tenhagen, B-A., Irrgang, A. (2021). Isolation Procedure for CP E. colikurz fürEscherichia coli from Caeca Samples under Review towards an Increased Sensitivity. Microorganisms. 9, 1105. DOI: https://doi.org/10.3390/microorganisms9051105Pauly, N., Hammerl, J. A., Grobbel, M., Käsbohrer, A., Tenhagen, B-A., Malorny, B., Schwarz, S., Meemken, D., Irrgang, A. (2020). Identification of a blaVIM-1-Carrying IncA/C2 Multiresistance Plasmid in an Escherichia coli Isolate Recovered from the German Food Chain. Microorganisms. 9, 29. DOI: https://doi.org/10.3390/%20microorganisms9010029Pauly, N., Hammerl, JA., Schwarz, S., Grobbel, M., Meemken, D., Malorny, B., Tenhagen, BA., Käsbohrer, A., Irrgang, A. (2020). Co-occurrence of the blaVIM-1 and blaSHV-12 genes on an IncHI2 plasmid of an Escherichia coli isolate recovered from German livestock. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76(2), 531–533. DOI: https://doi.org/10.1093/jac/dkaa436 Diaconu, EL., Carfora, V., Alba, Pkurz fürPhosphor., Di Matteo, Pkurz fürPhosphor., Stravino, F., Buccella, C., Dell’Aira, E., Onorati, R., Sorbara, L., Battisti, A., Franco, A. (2020). Novel IncFII plasmid harbouring blaNDM-4 in a carbapenem-resistant Escherichia coli of pig origin, Italy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75(12), 3475–3479. DOI: https://doi.org/10.1093/jac/dkaa374Irrgang, A., Tausch SH., Pauly, N., Grobbel, M., Kaesbohrer, A,. Hammerl, JA. (2020). First Detection of GES-5-Producing Escherichia coli from Livestock—An Increasing Diversity of Carbapenemases Recognized from German Pig Production. Microorganisms. 8 (10), 159. DOI: https://doi.org/10.3390/microorganisms8101593Pauly, N., Hammerl, JA., Grobbel, M., Tenhagen, BA., Käsbohrer, A., Bisenius, S., Fuchs, J., Horlacher, S., Lingstädt, H., Mauermann, U., Mitro, S., Müller, M., Rohrmann, S., Schiffmann, AP., Stührenberg, B., Zimmermann, Pkurz fürPhosphor., Schwarz, S., Meemken, D., Irrgang, A. (2020). ChromID® CARBA Agar Fails to Detect Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae With Slightly Reduced Susceptibility to Carbapenems. Frontiers in Microbiology. 11, 1678. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01678Irrgang, A., Pauly, N., Tenhagen, BA., Grobbel, M., Kaesbohrer, A., Hammerl, JA. (2020). Spill-Over from Public Health? First Detection of an OXA-48-Producing Escherichia coli in a German Pig Farm. Microorganisms. 8(6), 855. DOI: https://doi.org/10.3390/microorganisms8060855Veldman, K., Slettemeås, JS., Granier, S., Perrin-Guyomard, A., Hechard, T., Dierikx, C., Maurischat, S. (2020). IMPART: an update of the study. Poster presented at One Health EJP Annual Scientific Meeting 2020. Online, 27-29th May 2020. DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.4066734Veldman, K., Slettemeås, JS., Grobbel, M., Börjesson, S., Dors, A., Franco, A., Haenni, M., Turner, Okurz fürSauerstoff., Broens, E. (2020). Susceptibility testing of veterinary pathogenic bacteria as a first step in setting new epidemiological cut-off values (ECOFFs). Poster presented at: One Health EJP Annual Scientific Meeting 2020. Online, 27-29th May 2020. DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.4066667Maurischat, S., Witt, Pkurz fürPhosphor., Maneck, C., Grobbel, M. and the OHEJP IMPART consortium (2020). Clostridioides difficile antimicrobial susceptibility testing using disc diffusion. Poster presented at: One Health EJP Annual Scientific meeting, 2020. Online, 27-29th May 2020. DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.7390483 Slettemeås, JS., Norström, M., Divon, H., Ilag, HK., Granier, S., Perrin-Guyomard, A., Haenni, M., Veldman, K., Hammerum, A., Börjesson, S., Kjeldgaard, JS., Irrgang, A., Dierikx, C., Randall, L., Smialowska, A., Franco, A. (2020). A multicenter study examining different culturing methods to detect carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Poster presented at One Health EJP Annual Scientific Meeting 2020. Online, 27-29th May 2020. DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.4066631