Verbesserung der Öffentlichen Gesundheit durch ein besseres Verständnis der Epidemiologie nagetierübertragener Krankheiten: Erregerverhalten und Epidemiologie von Leptospiren

Das Verbundvorhaben RoBoPub strebt einen interdisziplinären und synergistischen OneHealth-Ansatz zu zwei in Deutschland vorkommenden und meldepflichtigen Zoonosen, der Hantavirus-Erkrankung und der Leptospirose, an. Für beide Erkrankungen existieren eine Reihe von Gemeinsamkeiten, die starke Synergieeffekte in der Bearbeitung erwarten lassen. Das Ziel des RoBoPub-Verbundvorhabens ist es, Erkenntnisse über die Erreger, ihre Verbreitung, Wirtsassoziation, Umweltstabilität und Übertragung zu generieren. Außerdem sollen wirtsspezifische Faktoren wie Populationsschwankungen und diesen zugrundeliegende Umwelt- und Klimaparameter sowie die Seroprävalenz in menschlichen Bevölkerungskohorten untersucht werden. Schließlich sollen auch Risikowahrnehmung und Verhalten der Bevölkerung sowie die Sensibilisierung der niedergelassenen Ärzte betrachtet werden. Zusammenfassend beabsichtigt das RoBoPub-Konsortium, neue Erkenntnisse über zwei bedeutende autochthone Erreger zu nutzen, um Maßnahmen im Bereich der öffentlichen Gesundheit für die Prävention nagetierübertragener Infektionen zu entwickeln. Daher zielt das Konsortium darauf ab, die Präventionsmöglichkeiten für beide Pathogene durch die Erstellung eines Risikomanagementplanes für den öffentlichen Gesundheitsdienst (ÖGD) und die Erarbeitung von detaillierten Risikokarten, Frühwarnmodulen, Managementstrategien und Präventionsempfehlungen zu verbessern. Begleitend sollen das Risikobewusstsein der Allgemeinbevölkerung sowie der Risikogruppen erhöht und die Sensibilisierung der niedergelassenen Ärzte in endemischen Regionen verstärkt werden. Die gewonnenen Erkenntnisse sollen nicht nur in Maßnahmen des ÖGD gegen diese Erreger einfließen, sondern auch Rückschlüsse auf andere nagetierübertragene Zoonoseerreger, wie z.B. Orthopockenviren, ermöglichen.

AS1: Erreger-Geografie Meilenstein 1.1. Molekularbiologische Untersuchungen der vom FLIkurz fürFriedrich-Loeffler-Institut eingesandten Nagetierproben (Lebend- und Totfänge). In diesem Teilprojekt wurden molekularbiologische Untersuchungen der vom FLIkurz fürFriedrich-Loeffler-Institut und LFB Brandenburg eingesandten Nagetierproben durchgeführt. Alle eingesandten Proben (n=55 +19) wurden mittels PCR, SLST und MLST untersucht und an die Projektpartner weitergeleitet. Meilenstein 1.2. Kultivierung der Leptospiren aus Organen der vom FLIkurz fürFriedrich-Loeffler-Institut eingesandten Nagetierproben (Lebendfänge).
Leptospiren aus Organen der vom JKIkurz fürJulius Kühn-Institut/ LAVES eingesandten Nagetierproben (Lebendfänge) wurden kultiviert: Es konnten von den insgesamt 12 eingesandten Proben 2 Isolate gewonnen werden. Die isolierten Stämme wurden im Arbeitspaket AS2-AP4 genutzt Meilenstein 1.3. Protokoll für Metagenomanalyse zum Direktnachweis und der Typisierung von Leptospiren aus Primärproben verfügbar. Nach der Teilnahme an dem Workshop "Introduction to Whole Genome Sequencing and Analysis for Microbial Diagnostics" October 2017 in Dänemark wurde ersichtlich, dass die Sensitivität und Kosten für die routinemäßige Detektion und Typisierung von Primärproben mittels Metagenomanalyse nach dem derzeitigen Stand der Technik zu gering bzw. zu hoch sind. Stattdessen wurde eine real time PCR zur quantitativen Detektion von Leptospiren etabliert und nach ISO 17025 validiert. Es handelt sich dabei um die Validierung eines Verfahrens zum Nachweis pathogener Leptospiren in Körperflüssigkeiten (EDTA-Blut, Serum, Urin, Liquor) und Organmaterialien (z.B. Nierengewebe). Der Nachweis erfolgt über die Detektion des lipL32-Gens. Für die Bestimmung der NachweisgrenzeDialog schließenNachweisgrenzeLimit of detectionZum Glossareintrag, BestimmungsgrenzeDialog schließenBestimmungsgrenzeLimit of quantificationZum Glossareintrag und PCR-Effizienz wurden Verdünnungsreihen der DNA des Stammes L. interrogans Serogruppe Icterohaemorrhagiae Serovar Icterohaemorrhagiae ausgewertet. Die NachweisgrenzeDialog schließenNachweisgrenzeLimit of detectionZum Glossareintrag (limit of detection = LOD95%) liegt bei 5.551 Genomeinheiten (95 % Konfidenzintervall von 3.652 bis 8.451Genomeinheiten). Weiterhin wurde die Inklusivität mit 29 anderen Stämmen pathogener Leptospiren untersucht. Zum Testen der Exklusivität wurden 2 apathogene Leptospirenstämme der Spezies L. yanagawae und L. biflexa, sowie der Stamm Leptonema illini eingesetzt. Zusätzlich wurde DNA anderer Spirochäten mitgeführt, die aufgrund ihrer Verwandtschaft falsch-positive Ergebnisse hervorrufen können. Auch wurde die Sensitivität des Verfahrens in Urin und Blut mittels Spikingversuchen bestimmt. Die NachweisgrenzeDialog schließenNachweisgrenzeLimit of detectionZum Glossareintrag lag bei 102 Leptospiren/mlkurz fürMilliliter. .   AS2: Stabilität und Wirtsassoziation Meilenstein 2.1.  Tenazitätsstudien
Eine intensive Literaturrecherche zur Tenazität von Leptospira spp. in Umweltmatrizen wurde durchgeführt, die Daten wurden als Poster: " Survival of Leptopira spp. in soil and water: A literature review" bei dem ELS Scientific Meeting 2018 in Italien vom 24.05.2018-26.05.2018 präsentiert. Fazit des Reviews war, dass Umweltparameter, wie pH, Feuchtigkeit und UV-Strahlung einen Einfluss auf das Überleben der Leptospiren außerhalb des Wirtes haben. Jedoch stehen nicht genug Daten zur Verfügung, um die Überlebenszeit der Leptospiren in Abhängigkeit dieser Parameter zu vergleichen und zu bestimmen. Das Review stellt die Relevanz neuer Daten dar, die durch die Tenazitätsuntersuchungen im Rahmen dieses Vorhabens generiert und bewertet werden sollen. Basierend darauf wurden in Zusammenarbeit mit der Universität Leipzig erste Untersuchungen zum Überleben in Erde gemacht. Die Ergebnisse der Literaturrecherche wurden in der Veröffentlichung zum Überleben der Leptospiren in Urin in Zusammenarbeit mit der Universität Leipzig verwertet.  Untersuchungen zum Überleben von Leptospiren auf Erdbeeren wurden mittels Spiking-Experimente mit Referenz- und Feldstämmen von L. kirschneri durchgeführt und eine zeitliche Kinetik durch Mikroskopie, der in AP1 neu etablierten PCR und Kultivierung der Leptospiren ermittelt. Die Zählverfahren für die Tenazitätsuntersuchungen wurden nach einem Trainingsaufenthalt am Referenzlabor in Amsterdam etabliert. Die Tenazitätsuntersuchungen wurden zunächst mit einem Leptospira kischneri serovar Grippotyphosa Laborstamm durchgeführt und wurden mit einem Feldstamm (Leptospira kischneri serovar Grippotyphosa Sequentyp 110), der während des Erdbeerfeldausbruchs 2007 aus einer Feldmaus isoliert wurde, wiederholt. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Stämmen nachgewiesen (z=0, p=1). Wie auch der erste Stamm zeigte der Feldstamm, dass die Temperatur das Überleben beeinflusst. Höhere Temperaturen (>21°C) unterstützen die Überlebenszeit signifikant (z=4.10, p<0.001). Mit steigender Inkubationszeit verschlechtert sich die Tenazität signifikant (z=-7.01, p<0.001). Leptospira kirschneri kann bis zu 6h auf Erdbeeren überleben. Das Risiko für den Konsumenten steigt, wenn der Erdbeerkonsum auf dem Feld stattfindet und unterstützende Bedingungen, wie hohe Temperaturen und häufiger Niederschlag zusammentreffen. Die Daten wurden bei PlosOne veröffentlicht.
Meilenstein 2.2. Krankenhäuser rekrutiert und Protokoll zum Transport und der Isolierung von Leptospiren aus Blutkulturen verfügbar. Um ein Protokoll für die Krankenhäuser zur Verfügung zu stellen wurden DNA-Extraktionsversuche, qPCR Untersuchungen und Kultivierungsversuche aus Blutkulturen durchgeführt. Ferner wurden Krankenhäuser rekrutiert und Transportmedium, als auch das etablierte Protokoll versandt.
Meilenstein 2.3. Kultivierung der Leptospiren aus Blutkulturen abgeschlossen; isolierte Stämme werden im Arbeitspaket AS2-AP4 genutzt. In dem Projektzeitraum wurden keine humanen Leptospirenisolate gewonnen. Die Wahrscheinlichkeit ein Isolat zu gewinnen ist aufgrund der niedrigen Leptospiroseinzidenz, als auch der schwierigen Leptospirenan-zucht, gering. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen wurde eine Kooperation mit dem Bernard Nocht Institut begonnen, welches im Vergleich zu anderen Krankenhäusern vermehrt Leptospirose Fälle behandelt.
Meilenstein 2.4. Vergleichenden Genomanalyse
Die in AS1-AP2 beschriebenen Stämme und weitere 25 Leptospirenstämme aus der Stammsammlung des Konsilliarlabors wurden kultiviert und mit dem am BfRkurz fürBundesinstitut für Risikobewertung verfügbaren MiSeq-System sequenziert. Ferner wurde ein Protokoll zur Herstellung einer Genombibliothek mit Hilfe des Nextera XT Library Prep Kit etabliert und angewendet. Mit den bioinformatischen Auswertungen der Sequenzen wurde begonnen. In der 2. Förderphase ist die Anwendung von Methoden zur Assemblierung der Genomsequenzen mittels SPADES oder Velvet, Suche und Abgleich von VirulenzDialog schließenVirulenzVirulenzZum Glossareintrag- und Resistenzgenen mittels z.B. Virulenzfinderdatenbank oder CGE Tools geplant. Weitere Methoden zur Auswertung sollten am Ende der ersten Förderphase in Kooperation mit dem Institut Pasteur in Paris erlernt, durchgeführt und am BfRkurz fürBundesinstitut für Risikobewertung etabliert werden. Dieser Aufenthalt musste aufgrund der Coronakrise abgesagt werden.
AS3: Epidemiologie Meilenstein 3.1. Serologische Untersuchungen der vom NLGA eingesandten Serumproben
Eine Zusammenarbeit mit dem NLGA bezüglich der serologischen Untersuchung der Humanseren von Risikogruppen (Waldarbeiter) fand statt. Weiterhin wurde ein serologischer Methodenvergleich zwischen dem BfRkurz fürBundesinstitut für Risikobewertung in-house ELISA und dem kommerziell erhältlichen ELISA der Firma Virion/Serion sowie dem Goldstandard-Test MAT durchgeführt. Es wurden insgesamt 146 Seren untersucht.  Diese neuen Daten wurden gemeinsam mit ehemaligen Daten (insgesamt 525 Proben) einer statistischen Auswertung unterzogen. Mit Hilfe des Cohen’s Kappa Tests wurden signifikante Unterschiede zwischen den Tests nachgewiesen. Eine Bayessche Modellierung der Daten soll veröffentlicht werden, das Manuskript ist in Arbeit.   AS6: Public Health Translation Meilenstein 6.1. Überführung der Ergebnisse in Maßnahmen des öffentlichen Gesundheitsdienstes Alle Ergebnisse wurden den Verbundpartnern zur weiteren Bearbeitung, Darstellung und Nutzung bei der Umsetzung zu Maßnahmen für den ÖGD zur Verfügung gestellt. Auch wurden die Ergebnisse in den Projektmeetings vorgetragen und im Rahmen eines ÖGD Workshops dargestellt. •           Teilnahme an RoBoPub-Projektmeeting, am 14.05.2018 in Berlin •           Teilnahme an RoBoPub-Projektmeeting, am 17.10.2018 in Berlin •           Teilnahme an RoBoPub-Projektmeeting, am 13.05.2019 in Berlin •           Teilnahme an RoBoPub-Projektmeeting, am 16.10.2019 in Berlin •           Teilnahme an RoBoPub-Projektmeeting, am 28.05.2020 virtuell •           Teilnahme an dem Workshop Nagetier-übertragene Zoonosen der Nationalen Forschungsplattform für Zoonosen, am 27.11.- 30.11.2018 in Berlin •           Teilnahme an dem Workshop des Netzwerkes „Nagetier-übertragene Pathogene“, am 28.-30. November, Berlin Zur Aufklärung der Ärzteschaft und des ÖGD wurde das Manuskript: „Leptospirose in Deutschland: Aktuelle Erkenntnisse zu Erregern, Reservoirwirten und Erkrankungen bei Mensch und Tier“ in deutscher Sprache und im Bundesgesundheitsblatt frei verfügbar publiziert.