Standardisierung molekularer Nachweisverfahren zur Verbesserung der Risikobewertungskapazität für lebensmittelbedingte Protozoenparasiten, wobei Cryptosporidium im verzehrfertigen Salat als Modell verwendet wird.

Protozoen wie Cryptosporidium spp., Giardia duodenalis und Toxoplasma gondii sind wichtige Ursachen für menschliche und tierische Erkrankungen. Schätzungen zufolge verursachten diese drei Parasiten im Jahr 2010 in Europa etwa 47 Millionen Krankheitsfälle (InzidenzDialog schließenInzidenzInzidenzZum Glossareintrag 185 Fälle pro 100.000 Einwohner). In den vergangenen Jahren wurden Ausbrüche welche mit dem Verzehr von Lebensmitteln (v.a. Blattgemüse) assoziiert waren, zunehmend erkannt und gemeldet. Es fehlen allerdings weiterhin leicht anwendbare und standardisierte Methoden zur Untersuchung von Lebens- und Futtermitteln. Dies führt zu einer Untererfassung der Krankheitsfälle und erschwert das Erstellen aussagekräftiger Risikobewertungen und die Einführung und Validierung von Kontrollpunkten bei der Herstellung von Lebensmitteln. Daher war das Ziel des IMPACT-Projekts, durch eine Verbesserung der Diagnostik von Protozoen auf verzehrfertigen Salaten (Modelkeim Cryptosporidium spp.), die Datengrundlage für Risikobewertungen auf europäischer Ebene zu erweitern. Das erste Ziel war eine Überprüfung derzeit publizierter Verfahren zum Nachweis von Cryptosporidium in Frischprodukten und die Erstellung einer Leitlinie für die Durchführung künstlicher Kontaminationsstudien zur Verifizierung und Validierung von Nachweismethoden. Dies wurde durch Literaturrecherchen, eine Marktumfrage bei Oozystenherstellern und -lieferanten, Verteilung von Fragebögen, E-Meetings und einem Expertenworkshop erreicht. Ferner wurde mittels Literaturrecherche eine qPCR identifiziert, auf deren Grundlage eine SOP für den molekularen Cryptosporidium-Nachweis von Oozysten in Blattgemüse in zwei Laboren entwickelt wurde. Die Validierung der entwickelten SOP erfolgte in vier Partnerlaboren, Video-Tutorials wurden zusammengestellt, um die SOP-Implementierung zu erleichtern. An der finalen Validierung der SOP durch einen Ringversuch waren fünf Partner des Konsortiums sowie sieben weitere europäische Labore beteiligt.

Dies ist eine kurze Zusammenfassung der Projektergebnisse. Detaillierte Informationen entnehmen Sie bitte dem Bericht, der unter https://www.efsa.europa.eu/de/supporting/pub/en-7195 erhältlich ist Unterschiedliche Protokolle für die künstliche Kontamination von pflanzlichen Lebensmittels mit Protozoen und das Fehlen von Berichten über die Effizienz und Leistung von Methoden, die bei Untersuchungen von Frischprodukten verwendet werden, haben Vergleiche und das Verständnis des Auftretens von Parasiten wie Cryptosporidium erschwert. Durch eine Kombination aus Umfragen, Konsultationen und einem Workshop haben wir Leitlinien entwickelt, von denen wir erwarten, dass sie die  Vergleichbarkeit von Assays verbessern und zu einer verbesserten Methodenentwicklung und Berichterstattung  führen. Die in diesem Projekt entwickelten Leitlinien sollten in Zukunft von Laboren übernommen werden, die Studien zur künstlichen Kontamination durchführen. Die Leitlinien wurden zur Aufnahme in der   "ISO/TC 34/SC 9/WG 3 ‘Method validation’ for incorporation in to Microbiology of the food chain — Method validation — Part #: Protocol for the validation of alternative methods against a reference method for viruses, and parasites and other difficult to culture microorganisms" vorgeschlagen. Obwohl viele Artikel, die molekulare Methoden zum Nachweis von Cryptosporidien beschreiben, im Rahmen des der systematischen Übersichtsarbeit und den Fragebögen identifiziert wurden, wurden nur wenige der beschriebenen Methoden vollständig validiert und erfüllten als solche nicht unsere Erwartungen. Die meisten Methoden wurden aufgrund von Kreuzreaktivität (insbesondere bei Umweltproben), Schwierigkeiten bei der Interpretation der Ergebnisse, Nichtanwendbarkeit auf alle Cryptosporidium-Spezies und/oder unzureichender Validierung als ungeeignet befunden. Die von Kristin Elwin von Public Health Wales (PHW) auf dem IMPACT-Workshop vorgestellte qPCR zielte auf alle Cryptosporidium-Spezies ab, hatte eine hohe analytische SensitivitätDialog schließenanalytische SensitivitätLimit of detectionZum Glossareintrag, hohe Spezifität und eine gute Unterscheidungskraft für Cryptosporidium-Spezies durch Sanger-Sequenzierung und wurde daher als geeignete Methode ausgewählt und für die Zwecke des IMPACT-Projekts verwendet.
Ein vergleichender und iterativer experimenteller Ansatz wurde zur Bewertung und Optimierung der drei verschiedenen Schritte des Verfahrens zum Nachweis von C. parvum-Oozysten-DNA in Blattgemüse angewendet. Eine SOP wurde erstellt und konnte in allen Partnerlaboren selbst mit geringer oder keiner Fachkompetenz implementiert werden, sofern mindestens eine Online-Schulung angeboten wurde. Die Ringversuchsergebnisse der geschulten Labore spiegelten die Ergebnisse wider, die während der Validierungs-/Implementierungsphase des Projekts gefunden wurden, und es wurde eine Nachweisbarkeit von 10 Oozysten erreicht. Die SOP erwies sich als robust und erreichte unabhängig von den verwendeten Reagenzien oder Geräten die erwartete Leistung.Anhand der Ringversuchsergebnisse der externen Labore wurde deutlich, dass bei der Implementierung der SOP in einem neuen Labor eindeutig Übungs- und Verifizierungsschritte notwendig sind. Vor allem eine Überprüfung des Mastermixes und die Bestimmung des Ct-Grenzwertes sind notwendig. Wir empfehlen außerdem, vor der Implementierung eine Schulung im Expertenlabor zu planen oder auf Online-Schulungsressourcen (z. B. in diesem Projekt erstellte Video-Tutorials) zurückzugreifen.