Identifizierung der Struktur-abhängigen Toxizität von hepatotoxischen Pyrrolizidinalkaloiden

Die Gruppe der ungesättigten Pyrrolizidinalkaloide (PA) zählt zu den giftigsten bekannten Substanzen. Die PA umfassen mehr als 400 Alkaloide, die unter anderem im Gemeinen Greiskraut (Senecio vulgaris L.) vorkommen. PA wurden unter anderem in Honig und Tee in signifikanten Mengen nachgewiesen. Aus Vergiftungsfällen durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln ist bekannt, dass PA bei Mensch und Tier lebensbedrohliche Leberschäden verursachen können. Im Tierversuch wirken diese Alkaloide krebserregend und in verschiedenen in vitro- und in vivo-Tests genotoxisch. Die toxische Wirkung der PA entsteht durch die enzymatischen Umwandlungen durch die hauptsächlich in der Leber exprimierten Enzyme, ist jedoch auch abhängig von ihrer oralen Bioverfügbarkeit. Die Bioverfügbarkeit der PA ist bisher wenig untersucht und die molekularen Wirkmechanismen, die die Toxizität verursachen, noch nicht vollständig aufgeklärt. Basierend auf unseren Voruntersuchungen zur Bioverfügbarkeit und zu den molekularen Wirkmechanismen der PA, die deutliche Hinweise auf eine Struktur-Aktivitätsbeziehung der strukturell verschiedenen, untersuchten PA Heliotrin, Echimidin, Senecionin und Senkirkin zeigten, soll im Rahmen dieses Antrags eine Eingruppierung der PA in verschiedene Toxizitätsgruppen realisiert werden. Dazu soll die Bioverfügbarkeit in einem in vitro-Modell der humanen Darmbarriere mit einem großen Satz an PA (22) untersucht werden. Hier soll als Endpunkt der ABCB1-abhängige Transport in Richtung Darmlumen untersucht werden. Diese „Entgiftungsreaktion“ soll als erste Charakteristik für die Struktur-abhängige Wirkung der PA dienen. Im Weiteren sollen die molekularen Mechanismen der PA in der Leber untersucht werden. Dazu soll in vivo in Echtzeit mit Hilfe der Zweiphotonenmikroskopie die Induktion der Lebertoxizität untersucht werden.

1,2-Ungesättigte Pyrrolizidinalkaloide (PA) sind die am weitesten verbreiteten natürlichen Toxine. Durch den Verzehr von kontaminierten Nahrungsmitteln ist der Mensch diesen Substanzen direkt ausgesetzt. Eine PA-Vergiftung kann zu schweren Leberschäden, wie z.B. der Lebervenenverschlusskrankheit (VOD) führen. PA sind per se nicht toxisch. Erst in der Leber erfolgt ihre enzymatische Aktivierung zu hochreaktiven Metaboliten, die DNA und Proteinaddukte bilden können. Über die molekularen Wirkmechanismen von PA ist bislang wenig bekannt. Dieses Projekt soll dazu beitragen, die molekularen Wirkmechanismen und insbesondere die Struktur-Aktivitäts­beziehungen der PA zu untersuchen, um die Entfaltung der PA-induzierten Toxizität im Menschen weiter aufzuklären und eine mögliche Gefährdung des Menschen durch die PA-Aufnahme besser abzuschätzen zu können. Die unmittelbaren Ziele dieses Projektes umfassten die Aufklärung der strukturabhängigen Aufnahme über das intestinale Epithel in vitro (Caco-2-/MDCKII-Zellmodell) und die strukturabhängige Induktion von lebertoxischen Effekten in vitro. Endpunkte zur Analyse der Lebertoxizität waren dabei die Induktion von Zytotoxizität und Apoptose sowie die Störung der Gallensäurehomöostase. Die Passage von strukturell verschiedenen PA über das intestinale Epithel wurde mit Hilfe des Caco‑2- und MDCKII-Zellmodells untersucht. In Vorarbeiten zu diesem Projekt wurde die Hypothese erarbeitet, dass PA abhängig von ihrer Struktur das intestinale Epithel passieren, was direkt mit einem ABCB1-abhängigen Efflux assoziiert sein sollte. Diese Hypothese konnte infolge dieses Projektes nicht bestätigt werden. Es zeigte sich in allen Strukturtypen unabhängig von der Necinbase oder dem Veresterungsgrad ein potenziell ABCB-1-abhängiger Efflux. Wir konnten trotzdem zeigen, dass PA in unterschiedlichem Maße das intestinale Epithel passieren. Auf die in vivo-Situation übertragen bedeutet dies, dass PA mit dem Pfortaderblut in die Leber gelangen. Die strukturabhängige Induktion lebertoxischer Effekte wurde im zweiten Teil dieses Projektes systematisch untersucht. Eine diesem Projekt vorausgegangene Transkriptomstudie von primären humanen Hepatozyten, die mit vier strukturell verschiedenen PA behandelt wurden, lieferte Hinweise auf Endpunkte, die zur Beantwortung dieser Fragestellung geeignet schienen. Nach der Etablierung eines geeigneten Leberzellmodells, wurde die Induktion von Zytotoxizität, die Induktion von Apoptose und die Störung der Gallensäurehomöostase mit einem Set von zuerst 22, dann 14 PA in der humanen Hepatomzelllinie HepaRG untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen deutlich über alle Endpunkte eine starke Gruppierung der PA. Die PA-Monoester haben auf keinen der untersuchten Endpunkte einen induzierenden Effekt, wohingegen zyklische PA und offenkettige Diester (besonders des Heliotridintyps) besonders toxisch wirken. Auch die Störung der Gallensäurehomöostase geht einher mit der Gruppierung, die in den Zytotoxizitätsuntersuchungen erarbeitet wurde. Somit zeigen unsere Untersuchungen in der Leber starke strukturabhängige Unterschiede in der Induktion toxischer Effekte. Dies ist möglicherweise mit unterschiedlichen zellulären Aufnahmemechanismen und/oder Enzymaffinitäten zur Bioaktivierung assoziiert.In einem letzten Teil des Projektes wurde die Induktion der Lebertoxizität in vivo in Mäusen mit dem PA Senecionin als Vertreter untersucht. In dieser Studie konnte eine zeit- und dosisabhängige Induktion schwerster Leberschädigungen, die mit einem Anstieg der Leberparameter ALT und AST einhergingen, nachgewiesen werden. Durch die Nutzung einer Reportermaus mit grün-fluoreszierenden Endothelzellen konnten spezifisch die Endothelzellen als Target der PA-induzierten Lebertoxizität bestätigt werden. Diese Effekte waren begleitet durch eine perizentrale Leberzellnekrose, starken Einblutungen und einer Störung der Gallensäuresekretion. Außerdem konnte eine Infiltration von Immunzellen beobachtet werden. Zur Untersuchung der Metabolismus­abhängigkeit dieses Effekts wurden Por-knockout-Mäuse verwendet, die keine CYP-Aktivität mehr aufwiesen. In diesen Mäusen konnten keine lebertoxischen Effekte nach Senecionin-Behandlung identifiziert werden. Somit konnten wir hier klar zeigen, dass der Entfaltung der starken lebertoxischen Eigenschaften des Senecionins eine metabolische Toxifizierung durch CYP vorausgehen muss.Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass sich strukturabhängige Eigenschaften der PA nicht pauschalisieren lassen. Obwohl wir in der Leber ein Muster identifizierten, was sich in allen Ebenen der Untersuchungen reproduzieren ließ, so konnten wir bezüglich der Passage über das intestinale Epithel diese Gruppierung nicht wieder finden, was jedoch auch mit den gewählten Modellen assoziiert sein kann. Somit bleibt Vorsicht geboten, einer einheitlichen Gruppierung zu folgen, wichtiger ist es, die Endpunkte und Fragestellung separat zu betrachten.