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Entwicklung und Anwendung einer tierversuchsfreien Teststrategie aus in silico und in vitro Methoden zum effizienten Nachweis von Substanzwirkungen anhand morphologischer und molekularer Fingerabdrücke per HT/HC Screening (MORPHEUS: MORPHology-based Endocrine DisrUptor Screening)
04/2022-03/2025
Förderprogramm / Mittelgeber: Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) - Deutschland
Förderkennzeichen: 16LW0137K
Internetseite des Drittmittelprojektes: http://www.bf3r.de
Beschreibung des Projektes:
Gesamtziele des Vorhabens
In der Toxikologie wird die Wirkung von Substanzen, die Tumore auslösen indem sie z.B. das endogene Hormonsystem stören (sogenannte endokrine Disruptoren), oder Substanzen, die durch spezifische Organtoxizität die Gesundheit gefährden, vor allem in extrem aufwendigen Tierversuchen untersucht, die eine hohe Anzahl an Versuchstieren benötigen. Im MORPHEUS Projekt soll der kürzlich von VP1 publizierte E-Morph Assay (Kornhuber et al. 2021), einer in vitro Methode zum Nachweis östrogen-wirksamer Substanzen in einer menschlichen Brustkrebszelllinie, weiterentwickelt und dessen Anwendungsbereich zum Nachweis von Kanzerogenität und Organtoxizität deutlich erweitert werden. Mittels Cell Painting und „unbiased phenotypic profiling“ sollen dabei Substanz/-gruppen-spezifische morphologische Änderungen sub-/zellulärer Strukturen identifiziert werden, die als „morphologische Fingerabdrücke“ eine zuverlässige Unterscheidung von endokriner wie auch (organ-)toxischer Aktivität von Testsubstanzen per phänotypischem High-Throughput/High-Content (HT/HC) Screening ermöglichen. Zudem werden die morphologischen Fingerabdrücke (morphologische Veränderungen der Zellen) mit „molekularen Fingerabdrücken“ (Struktureigenschaften der Substanzen) in einem iterativen Prozess kombiniert, um in silico Vorhersage-Modelle zu entwickeln, die die effektive Identifizierung von Substanzen mit endokriner oder (organ-)toxischer Wirkung in umfangreichen Chemikalienbibliotheken erlauben. Die im Rahmen des MORPHEUS Projektes entwickelte Teststrategie aus in vitro und in silico Methoden soll zukünftig dazu beitragen, entsprechende Tierversuche zu reduzieren und soll sowohl in der toxikologischen Sicherheitsprüfung als auch in der biomedizinischen und pharmazeutischen Forschung im Rahmen von Untersuchungen von Substanzwirkungen auf die Krebsentstehung und -entwicklung Anwendung finden.
Wissenschaftliche und technische Arbeitsziele des Vorhabens
Im ersten Jahr („from images to numbers“) werden zwei bei VP1 und VP2 etablierte Methoden kombiniert (E-Morph Assay, Cell Painting) und entsprechende Technologien (HT/HC Screening und Bildanalyse-Pipelines) ausgetauscht, implementiert und adaptiert. Die Durchführung des für Cell Painting und HT/HC Screening angepassten E-Morph Assays wird in einer SOP (Standard Operating Procedure) detailliert festgeschrieben und die erfolgreiche Übertragung des kombinierten Assays durch eine anschließende Prä-Validierung mit geeigneten Referenzsubstanzen sichergestellt. In diesem Zeitraum erfolgt gleichzeitig durch VP3 die Entwicklung von in silico Methoden basierend auf morphologischen Inputdaten für die im weiteren Projektverlauf geplante Identifizierung morphologischer Fingerabdruck-Muster (Jahr 2, „from numbers to patterns“) und die Vorhersage von Substanzwirkungen (Jahr 3, „from patterns to predictions“). Zur Identifizierung spezifischer morphologischer und molekularer Fingerabdrücke werden im Rahmen eines „Pilot-Screenings“ zwei unterschiedliche Substanzbibliotheken („Bioactive Library“, „BfR Library“) mit dem kombinierten Cell Painting E-Morph Assay jeweils durch VP1 und VP2 analysiert. Die gewonnenen Ergebnisse erlauben neben der Identifizierung relevanter Fingerabdruck-Muster (VP3) auch die detailliertere Beurteilung der Transferierbarkeit des E-Morph Assays als entscheidende Planungsgrundlage für zukünftige Validierungsstudien. Die identifizierten Fingerabdrücke werden anschließend für die Entwicklung von in silico-Vorhersagemodellen für aktive Substanzen genutzt (VP3). In einem iterativen Prozess werden die Vorhersagen im Rahmen eines „Proof-of-Concept-Screenings“ jeweils durch in vitro „phenotypic profiling“ mit dem kombinierten Cell Painting E-Morph Assay überprüft und verfeinert und somit kontinuierlich für eine zukünftige Anwendung im Rahmen eines „Follow-up Screenings“ weiterentwickelt.
Projektpartner
- Institut für Physiologie (Institut für Physiologie) (Charité - Universitätsmedizin Berlin)
- Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie im Forschungsverbund Berlin e. V. (FMP) - Deutschland