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Vergleichender Metabolismus von 2-Monochloropropan-1,3-diol (2-MCPD) und 3-Monochloropropan-1,2-diol (3-MCPD) in Ratte und Mensch (Metabolismus von chlorierten Propandiolen in Ratte und Mensch)

03/2022-02/2025

Förderprogramm / Mittelgeber: Deutsche Forschungsgemeinschaft e.V. (DFG) Bonn - Deutschland

Förderkennzeichen: MO 2520/2-1 - Projektnummer 468535752

Internetseite des Drittmittelprojektes: -

Beschreibung des Projektes:

Zusammenfassung

Fettsäureester von 2-Monochlorpropan-1,3-diol (2-MCPD) und 3-Monochlorpropan-1,2-diol (3-MCPD) sind hitzeinduzierte Lebensmittelkontaminanten, die im Magen-Darm-Trakt hydrolysiert werden, was zur Freisetzung von 2/3-MCPD führt. Die Internationale Agentur für Krebsforschung (IARC) hat 3-MCPD als möglicherweise krebserregend für den Menschen eingestuft. Der TDI von 3-MCPD (2,0 µg kg/Körpergewicht) ist etwa doppelt so hoch wie die mittlere Aufnahmemenge bei Säuglingen (0,9 µg kg/Körpergewicht pro Tag) und wird von Säuglingen überschritten, die ausschließlich Säuglingsnahrung erhalten (mittlere Exposition: 2,4 µg/kg Körpergewicht pro Tag).

Die molekularen Mechanismen, die die Toxizität und Karzinogenität von 2/3-MCPD bei Ratten erklären, sind nicht gut erforscht. Ein besseres Verständnis hängt von den verfügbaren Informationen zum Metabolismus beider Verbindungen ab. Das könnte auch dazu beitragen, die Relevanz einiger der bei Ratten beobachteten toxischen Wirkungen für die menschliche Gesundheit zu klären. Der vorliegende Antrag zielt auf die vergleichende Aufklärung des Metabolismus von 2/3-MCPD bei Ratten und Mensch ab. Die Ratten erhalten orale Einzeldosen von 2- oder 3-MCPD und auch von [13C3]2-MCPD oder [13C3]3-MCPD. Die Metaboliten im Urin werden durch präparative Chromatographie aufgetrennt und durch Massenspektrometrie (MS) und 13C-kernmagnetische Resonanz (NMR)-Spektroskopie charakterisiert. Die Daten zu dem Rattenstoffwechsel werden die Grundlage für die Charakterisierung von 2/3-MCPD-Metaboliten bilden, die in menschlichen Urinproben ausgeschieden werden.

Die Informationen zum 2/3-MCPD-Metabolismus dienen als Grundlage für die Auswahl humaner Expositions-Biomarker für beide Substanzen. Wir schlagen vor, Analysetechniken zur Quantifizierung von Metaboliten von 2/3-MCPD im 24 h-Urin zu entwickeln. Die ausgewählten Biomarker werden zur Abschätzung der externen 2/3-MCPD-Exposition von Studienteilnehmern mit verschiedenen Ernährungsgewohnheiten (Omnivore, Veganer und Rohköstler) verwendet. Zusammenfassend werden die bereitgestellten Daten zum 2/3-MCPD-Metabolismus bei Ratten und beim Menschen helfen, die toxischen Wirkungen bei Ratten und möglicherweise die Relevanz für den Menschen zu verstehen, und durch die Bestimmung der menschlichen Exposition zukünftige Risikoempfehlungen zu unterstützen.

Spezifische Ziele

1. Identifizierung einzelner Metaboliten von 2- und 3-MCPD bei Ratten.
2. Identifizierung einzelner Metaboliten von 2- und 3-MCPD beim Menschen nach Aufnahme von kontaminiertem Haselnussöl.
3. Entwicklung von Isotopenverdünnungs-LC-MS/MS-Methoden zur Quantifizierung der wichtigsten menschlichen Metaboliten von 2- und 3-MCPD und Prüfung ihrer Anwendbarkeit als Biomarker der Exposition.

Ziel 1: Identifizierung einzelner Metaboliten von 2- und 3-MCPD im Rattenurin nach oraler Verabreichung von 2- oder 3-MCPD und [13C3]2- oder [13C3]3-MCPD

1.1 Strategie

Wistar-Ratten werden mit einzelnen oralen Dosen von 2- oder 3-MCPD und den entsprechenden 13C-markierten Verbindungen behandelt. Urinproben werden über 48 h gesammelt und die Metaboliten werden durch MS- und NMR-Spektroskopie identifiziert. Wie unten beschrieben, unterstützt die 13C-Markierung die Identifizierung, strukturelle Charakterisierung und Quantifizierung von MCPD-spezifischen Metaboliten durch MS- und 13C-NMR-Spektroskopie. Der schrittweise Arbeitsplan ist wie folgt.

S1) Untersuchung der Metaboliten im Urin mittels LC-MS und LC-MS/MS, um eine Liste mit möglichen Metaboliten im Urin von 2- und 3-MCPD zu erstellen.

S2) Auftrennung der Urinproben durch präparative HPLC, um die Urinmatrix abzureichern und die Metaboliten abzutrennen.

S3) Die molekularen Strukturen von 2- und 3-MCPD-Metaboliten werden mittels MS- und 13C-NMR-Spektroskopie aufgeklärt.

S4) Die 2- und 3-MCPD-Metaboliten in Fraktionen von Rattenurinproben werden mittels 13C-NMR-Spektroskopie quantifiziert.

1.2 Tierexperiment: Orale Gabe von 2- und 3-MCPD an Wistar-Ratten

Wistar-Ratten (n = 42, 7 bis 8 Wochen alt, Körpergewicht ~250 g) werden für fünf Tage akklimatisiert und dann in Stoffwechselkäfige gesetzt. Die Tiere erhalten per Schlundsonde einmalige orale Gaben von in Wasser gelöstem 2- oder 3-MCPD bzw. den jeweiligen isotopenmarkierten Verbindungen. Urinproben werden nach 24 h und 48 h gesammelt und bei –80°C gelagert.

1.3 Massenspektrometrischer Nachweis von Metaboliten von 2- und 3-MCPD in Urinproben (S1)

Das Hauptziel ist die Erhebung exakter Massen und Fragmentierungsmuster der Metaboliten von 2- und 3-MCPD. Darüber hinaus werden wir verschiedene Bedingungen testen, um die chromatographische Trennung der Metabolite zu optimieren. Die Ausrüstung besteht aus einer UltiMate™ 3000 UHPLC, die mit einem Orbitrap Q Exactive Focus System (Thermo Fisher) verbunden ist.

1.4 Fraktionierung von 2- und 3-MCPD-Metaboliten mit präparativer HPLC (S2)

Die Fraktionierung (z. B. über eine maßgefertigte Säule mit HSS-T3-Material (19 x 250 mm, Waters)) zielt auf die Abreicherung der Urinmatrix und die bestmögliche Isolierung der Metaboliten mit höchstmöglicher Reinheit ab, was die anschließende Charakterisierung erleichtert. Die erhaltenen Fraktionen werden unter Verwendung eines I-Class-UPLC-Systems (Waters) und einer HSS-T3-Säule (2,1 x 100 mm, Waters), die mit dem Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer QTRAP6500 (Sciex) verbunden ist, analysiert und unter reduziertem Druck konzentriert.

1.5 Strukturelle Charakterisierung von Metaboliten von [13C3]2- und [13C3]3-MCPD durch 13C-NMR-Spektroskopie (S3)

Die durch MS erhaltenen Strukturinformationen werden durch die Analyse isotopenmarkierter Metaboliten durch 13C-NMR-Spektroskopie ergänzt, eine Technik, die auch zur Charakterisierung von Metaboliten von Acrylnitril und Acrylamid angewendet wurde. Das Vorhandensein von Metaboliten im Urin von [13C3]2-MCPD und [13C3]3-MCPD (mit > 98 % 13C) führt zu intensiven NMR Signalen. Die 13C-NMR-Spektren werden mit einem VNMRS 500 MHz Spektrometer (Varian) bei der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM), Fachbereich 1.4 Prozessanalytik (Dr. Maiwald) in Berlin aufgenommen.

1.6 Quantifizierung von [13C3]2- und [13C3]3-MCPD und deren Metaboliten im Rattenurin (S4)

Die quantitative NMR (qNMR)-Spektroskopie hat sich zu einem wichtigen Werkzeug zur Gehaltsbestimmung organischer Substanzen entwickelt. Hier werden wir 13C-NMR-spektroskopisch die Konzentrationen der Metaboliten in den HPLC-Fraktionen von Urinproben von mit [13C3]2-MCPD und [13C3]3-MCPD behandelten Ratten (Abschnitt 1.4) bestimmen, die dann verwendet werden um die Gesamtmenge der Metaboliten im Urin zu berechnen.

2- und 3-MCPD im Urin und ihre Metaboliten 2-ClHA und 3-ClLA werden direkt mittels Isotopenverdünnungs-GC-MS und LC-MS/MS quantifiziert.

1.7 Erwartetes Ergebnis

Die Applikation relativ hoher Mengen an 2- und 3-MCPD sowie deren isotopenmarkierten Kongeneren im Tierexperiment ermöglicht die Identifizierung der häufigsten Metaboliten in den Urinproben. MS- und NMR-Spektroskopie liefern einen umfassenden Datensatz zur strukturellen Charakterisierung. Zusammengenommen sollen zwei Ziele erreicht werden: Die unvollständigen Schemata des 2- und 3-MCPD-Stoffwechsels bei Ratten sollen vervollständigt werden. Die Mengen der ausgeschiedenen Metaboliten spiegeln den Beitrag der verschiedenen Stoffwechselwege wider. Das zweite Ziel sind zwei kleine Substanzbibliotheken von Ratten-Metaboliten von 2- und 3-MCPD in Lösungen mit definierten Konzentrationen, die in ihrer natürlichen Form und zusätzlich als 13C-markierte Moleküle vorliegen.

Ziel 2: Metaboliten von 2- und 3-MCPD in menschlichen Urinproben

2.1 Strategie

Am BfR wurde eine kontrollierte Expositionsstudie mit 12 Teilnehmern durchgeführt, die 12 g handelsübliches Haselnussöl mit Fettsäureestern von 2- und 3-MCPD einnahmen. Es wurden die ausgeschiedenen Mengen an 2- und 3-MCPD sowie an 2-ClHA und 3-ClLA bestimmt. Wir schlagen vor, andere Metaboliten von 2- und 3-MCPD im menschlichen Urin zu identifizieren und zu quantifizieren. Die Proben werden ausgehend von massenspektrometrischen Verfahren mit relativ breiter Detektionsbreite (ungezielt, geringe Sensitivität) bis hin zu fokussierteren Detektionsmethoden (gezielt, hohe Sensitivität) analysiert. Es wird angenommen, dass der Metabolismus von Mensch und Ratte ähnlich ist und dass die Ergebnisse von Ziel 1 als Grundlage für die Identifizierung von 2- und 3-MCPD-Metaboliten in menschlichen Urinproben verwendet werden können. Die Schritte sind wie folgt:

S1) Einzelne menschliche Metabolite werden identifiziert und eine Liste mit Retentionszeiten, genauen Massen und massenspektrometrischen Fragmentierungsmustern wird zusammengestellt.

S2) Die Mengen einzelner Metaboliten in menschlichen Urinproben werden mittels Isotopenverdünnungs-LC-MS/MS bestimmt.

2.2 Massenspektrometrische Identifizierung von Metaboliten von 2- und 3-MCPD in menschlichen Urinproben (S1)

Probenvorbereitung: Die Identifizierung in Humanproben erfordert die Anreicherung der niedrig konzentrierten Metaboliten und die Depletion der Harnmatrix. Wir werden verschiedene Techniken vergleichen, da ihre Effizienz je nach den Eigenschaften der Zielmetaboliten variieren kann.

Drei Ansätze zur massenspektrometrischen Identifizierung: a) Full-Scan-Spektren. Die Identifizierung folgt einer ähnlichen Strategie wie in Abschnitt 1.3 beschrieben unter Verwendung des UltiMate 3000 UHPLC, das mit einem Orbitrap Q Exactive Focus verbunden ist. b) Gezielte MS. Ein sensitiverer Ansatz ist die gezielte Untersuchung von 2- und 3-MCPD-Metaboliten in humanen Urinproben anhand der Annotationslisten von Rattenmetaboliten. c) Screening auf erwartete Fragmentierungsmuster („Fixed-Step Selected Ion Monitoring“).

2.3 Massenspektrometrische Quantifizierung von Metaboliten von 2- und 3-MCPD in humanen Urinproben (S2)

Basierend auf den Daten zu Retentionszeiten und Fragmentierungsmustern wird eine Technik für den simultanen Nachweis von zuvor identifizierten 2- und 3-MCPD-Metaboliten (Abschnitt 2.2) durch LC-MS/MS-MRM entwickelt. Wir gehen davon aus, dass sich der Metabolismus von Ratte und Mensch ähnelt. Dadurch können die Bibliotheken von Lösungen, die die Metaboliten von [13C3]2-MCPD und [13C3]3-MCPD in bekannten Konzentrationen (Ziel 1) enthalten, als Referenzstandards für die Quantifizierung der menschlichen Metaboliten verwendet werden. Die MRM-Methode ermöglicht die Quantifizierung der Metaboliten von 2- und 3-MCPD in allen Urinproben der Humanstudie (264 Proben). Die Auswertung ergibt die Ausscheidungskinetik aller Metaboliten.

2.4 Erwartetes Ergebnis

Die Quantifizierung von 2- und 3-MCPD sowie der Metaboliten 3-ClLA und 2-ClHA in allen Urinproben nach kontrollierter Haselnussöl-Exposition ist abgeschlossen. Die massenspektrometrische Identifizierung menschlicher Metaboliten basierend auf den Daten des Rattenstoffwechsels (Ziel 1) ist eine vielversprechende Strategie, die die sich entwickelnden Schemata des menschlichen 2- und 3-MCPD-Stoffwechsels ergänzen wird.

Ziel 3: Biomarker im Urin für 2- und 3-MCPD-Exposition

3.1 Strategie

Metaboliten im Urin werden als Kurzzeit-Expositions-Biomarker bevorzugt. Die Daten zu menschlichen Metaboliten (Ziel 2) ermöglichen die Auswahl von Kandidatenverbindungen für die Expositionsabschätzung, die die Kriterien des sensitiven Nachweises und der Spezifität für 2-MCPD oder 3-MCPD erfüllen. Der Arbeitsablauf lässt sich wie folgt zusammenfassen:

S1) Die Spezifität der Biomarkerkandidaten, eine Voraussetzung für deren Verwendung zur Bestimmung der Exposition gegenüber 2- und 3-MCPD mittels Umkehrdosimetrie, wird bewertet.

S2) Das zuvor entwickelte Analyseverfahren (Abschnitt 2.3) wird für die Quantifizierung der Ziel-Biomarker durch Isotopenverdünnungs-LC-MS/MS optimiert.

S3) Die Biomarker werden zur Berechnung der 2- und 3-MCPD-Exposition anhand von 24-h-Urinproben aus zwei derzeit am BfR laufenden Studien zu gesundheitlichen Auswirkungen von Ernährungsgewohnheiten verwendet.

3.2 Bewertung der Spezifität der Biomarkerkandidaten (S1)

Die Auswahl von Biomarker für eine 2- und 3-MCPD-Exposition basiert auf den bisherigen Ergebnissen zum menschlichen Metabolismus (Abschnitt 2.3). Da die Spezifität der Biomarker entscheidend für die Anwendung in der Umkehrdosimetrie ist, werden wir verschiedene Aspekte untersuchen, um diesen Punkt zu klären.

3.3 Optimierung der Biomarker-Quantifizierung

Ein weiteres Hauptkriterium für die Auswahl von Biomarkern ist die Häufigkeit der Metabolite im Urin und die erwartete Durchführbarkeit eines analytischen Nachweises. Für die Quantifizierung werden isotopenmarkierte Standardsubstanzen der Zielanalyten von Firmen bezogen, die kundenspezifische Synthesen anbieten. Wir werden die in Ziel 2 (Abschnitt 2.3) entwickelten analytischen Methoden neu evaluieren und gegebenenfalls die Urinextraktion der Zielverbindungen (Wiederfindung), die chromatographische Trennung und die massenspektrometrische Quantifizierung durch MRM optimieren.

3.4 Bewertung der externen Exposition gegenüber 2- und 3-MCPD in Gruppen von erwachsenen Omnivoren, Veganern und Rohköstlern (S3)

Nach der Auswahl spezifischer Metabolite von 2- und 3-MCPD als Biomarker werden die optimierten Analysetechniken auf die Expositionsabschätzung bei Teilnehmern mit unterschiedlichen Ernährungsgewohnheiten (Omnivore, Veganer und Rohköstler) aus zwei Ernährungsstudien angewendet.

3.5 Erwartetes Ergebnis

Verschiedene Verbindungen, die zuvor als Urin-Biomarker für die Exposition gegenüber 2- und 3-MCPD angesehen wurden, fehlte es an Sensitivität und/oder Spezifität. Die vorgeschlagene Arbeit ermöglicht den Nachweis neuartiger Urin-Biomarker für 2- und 3-MCPD-Exposition und die Entwicklung geeigneter massenspektrometrischer Methoden für deren Quantifizierung im menschlichen Urin. Wenn die Exploration von Biomarkern nicht erfolgreich ist, können wir 2-MCPD und 3-MCPD selbst als Urin-Biomarker verwenden, um die äußere Belastung in den aktuellen Studien mit Omnivoren, Veganern und Rohköstlern am BfR (S3) zu untersuchen. Die Nachweissensitivitäten sind ein limitierender Faktor für ein zukünftiges Human-Biomonitoring mit 2- und 3-MCPD im Urin. Die Ausscheidung der in 24-h-Urinproben der Studienteilnehmer (S3) ermittelten Biomarker erlaubt eine Abschätzung der täglichen 2- und 3-MCPD-Exposition bei Omnivoren, Veganern und Rohköstlern. Detaillierte Daten zur Nahrungsaufnahme sind verfügbar. Korrelationen zwischen Lebensmittelklassen und Biomarkerausscheidung können die Hauptquellen der 2- und 3-MCPD-Exposition bei den Studienteilnehmern aufklären. Von besonderem Interesse ist, ob die Biomarker der 2- und 3-MCPD-Exposition bei Rohkost-Essern überhaupt nachweisbar sein werden, weil sie keine raffinierten Öle konsumieren.

Projektpartner

• Fachbereich 1.1 - Anorganische Spurenanalytik (BAM) (Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung)
• SGS Germany GmbH (SGS) - Deutschland

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