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Schnellnachweis und vor-Ort-Testung antimikrobieller Resistenz und mobiler genetischer Elemente in Human- und Tierproben mittels Metagenomik

01/2020-06/2022

Förderprogramm / Mittelgeber: Horizon 2020

Internetseite des Drittmittelprojektes: https://onehealthejp.eu/

Beschreibung des Projektes:

Die antimikrobielle Resistenz (AMR) bedroht einige der größten medizinischen Fortschritte in der heutigen Zeit. Die Detektion von AMR und der Erregernachweis sind aktuell in erster Linie auf klassische Kulturtechniken angewiesen, die möglicherweise langsam sind. Die Entwicklung neuer Werkzeuge für den Echtzeit-Nachweis resistenter Erreger ist ein Thema mit Priorität seitens des EJP. Die Vor-Ort- und Echtzeit-Analyse erfordert die Unabhängigkeit von Kulturtechniken, um schnelle Interventionen, insbesondere bei Ausbrüchen, zu ermöglichen. Darüber hinaus erfordert sie robuste Protokolle mit minimaler technischer Ausrüstung, die auch außerhalb der normalen Laborumgebung eingesetzt werden können. Die metagenomische Sequenzierung mittels short-read Daten kann die Zusammensetzung von Mikrobengemeinschaften zur Beurteilung potenzieller Krankheitserreger und AMR- oder Virulenzgene aufdecken und kann damit zu einem unschätzbaren diagnostischen Instrument werden. Allerdings können short-read Technologien einzelne Gene in einer Gemeinschaft nicht zuverlässig zu spezifischen Organismen zuordnen und stellen eine potenzielle Einschränkung für den Nachweis von AMR in Pathogenen dar.

Das FARMED-Projekt will diese Probleme angehen, indem es ONT MinION verwendet, diese Technologie mit anderen metagenomischen Sequenziertechnologien vergleichen und ihre Eignung für die diagnostische Anwendung für eine Reihe von Probenmatrizen sowohl im Labor als auch im Feld bewerten. Mit Hilfe der metagenomischen Sequenzierung mit long-reads kann der lokale genetische Kontext der AMR-Gene abgeleitet werden, und somit kann das Vorhandensein der AMR-Gene bestimmten Spezies und Plasmiden innerhalb der bakteriellen Gemeinschaft zugeordnet werden. Diese Technologie wird die Identifizierung einer Vielzahl von Bakterienarten und die Verknüpfung bestimmter Arten mit einer Reihe von AMR-Genen ermöglichen. Wir werden harmonisierte Protokolle für die Vor-Ort-Extraktion metagenomischer DNA und die Erstellung von Sequenzierungsbibliotheken für MinION erstellen. Gleichzeitig werden wir bestehende Methoden zur DNA-Extraktion mit dem ONT VolTRAX System anpassen. Darüber hinaus werden wir effiziente Echtzeit-Kartierungsstrategien entwickeln, die den Ursprung des genetischen Kontextes der AMR-Gene identifizieren, die Wirtsbakterienart identifizieren, um einen spezifischen Erregernachweis zu ermöglichen.

Zusätzlich zur Metagenom-Analyse vor Ort werden wir die besten Verfahren für die "off-site"-Analyse von Plasmidsequenzen durch Vergleich mit Isolaten untersuchen und etablieren. Wir werden die Verwendung von long-read und short-read Daten sowie eine Kombination der Technologien wie Hi-C vergleichen, um komplette Plasmide aus Metagenomdaten zusammenzusetzen. Die Hi-C-Sequenzierung ist eine neuartige Methode, die die Proximity-Ligation von DNA-Molekülen nutzt, um den genetischen Kontext von AMR-Genen in Bezug auf die Verknüpfung mit dem bakteriellen Wirts-Chromosom zu bestimmen. Definierte Gemeinschaften, die Isolate enthalten, die bekannte Plasmide beherbergen, werden verwendet, um zu bestimmen, ob aus diesen metagenomischen Daten Plasmidsequenzen abgeleitet werden können.

In einem interaktiven Workshop werden wir unsere umfangreichen Nass- und Trockenlabor-Erfahrungen, einschließlich der molekularen und bioinformatischen Expertise, aus diesem Projekt übertragen. Wir gehen davon aus, dass die aus FARMED hervorgehenden Methoden und Werkzeuge hoch attraktiv und in Kürze für ein breites Spektrum von Nutzern außerhalb des Konsortiums anwendbar sein werden, um die in Pathogenen in vielen verschiedenen Umgebungen vorhandene AMR schnell zu überwachen. Wir gehen davon aus, dass diese Technik besonders in Ländern mit niedrigem oder mittlerem Einkommen nützlich sein wird, in denen die Belastung durch das Auftreten von Krankheitserregern und AMR zwar hoch sein mag, aber nur begrenzt Zugang zu spezialisierten oder sogar "Standard"-Laborgeräten für die Diagnose besteht.

Projektpartner

• Sciensano
• Animal and Plant Health Agency
• DTU Fødevareinstituttet (National Food Institute)
• Wageningen Bioveterinary Research

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